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丁年平 杨冠东 张增峰 黄春喜 郑飞龙 杨永强
（广州工业微生物检测中心 广州 510663）
摘要：本实验对冰箱抗菌防霉检测方法进行了研究。结果表明，在冰箱杀菌检测，由于冰箱低温低湿的环境，以常规的玻片为载体时，对照冰箱中大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的自然消亡率高，作用24h达到99.9%，而以琼脂片为载体，由于琼脂片本身具有一定的水分，自然消亡率较低，琼脂片是冰箱杀菌检测中一种较合适的染菌载体；防霉检测中，除了需要对试验空间进行喷雾加湿，还应该定期对培养基表面加湿，才能保证培养基和霉菌所需的水分，对照冰箱中霉菌正常生长。
1.前言
家用电器的抗菌、除菌、净化等卫生功能作为一项附加功能，虽出现时间不长，但已为消费者所了解，并受到青睐[1]。现有的冰箱除菌标准，主要是关于冰箱部件及材料的抗菌防霉检测方法，而对于利用臭氧、紫外、负离子的杀菌冰箱的抗菌防霉检测方法研究较少，也没有相应的标准，目前对于这方面的检测主要依据《消毒技术规范》卫生部2002年版-2.1.5灭菌与消毒器械消毒功效鉴定试验[2]。但由于冰箱特殊的低温低湿环境，依照此方法进行检测时，若作用时间较短，对杀菌效果影响较小[3]，但作用时间较长时，主要出现了如下问题：若以传统染菌载体，玻片、滤纸片、棉布等，部分检测菌种的自然消亡率较高，杀菌率结果计算存在差异或难以计算；防霉检测中，培养基容易失水，对照冰箱霉菌不生长等。
本文通过试验，研究了以玻片及琼脂片为载体，臭氧杀菌冰箱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌、白色葡萄球菌的杀菌效果检测的影响；防霉检测中，对冰箱试验空间以及培养基表面进行喷雾加湿对试验结果的影响。
2.试验设备与材料
2.1试验设备
压力蒸汽灭菌器；恒温培养箱；天平，精确度± 0.01 g；三角烧瓶，配盖；移液管；酒精灯；接种环；培养皿；冰箱； O3测定仪。
2.2试剂、 培养基、缓冲液
营养琼脂、磷酸盐缓冲液（PBS）、YPD、PDA、改良察氏液体培养基（北京陆桥有限公司）
2.3菌种
抗菌检测：大肠杆菌 ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC6538、白色念珠菌ATCC 10231、绿脓杆菌ATCC15442、白色葡萄球菌8032
防霉检测：黑曲霉AS3.4463、绳状青霉AS33875、球毛壳霉AS34254、出芽短梗霉AS33984、土曲霉 AS33935、宛氏拟青霉 AS3.4253
3.试验方法
3.1抗菌检测方法的研究
3.1.1臭氧浓度检测
打开冰箱及臭氧发生器，将冰箱冷藏室温度设定在4℃。一天后，冰箱冷藏室达到4℃，检测臭氧浓度。
3.1.2 菌种活化
将标准菌株接种于营养琼脂斜面上，在（37±1）℃培养24h后，在5℃~10℃下保藏（不得超过一个月），作为斜面保藏菌。将斜面保藏菌转接到平板营养琼脂培养基，在（37±1）℃培养（24±1）h，每天转接1次，不超过2周。试验时应采用3代~14代，24h内转接的新鲜细菌培养物。
3.1.2 菌液的制备
用接种环从3.1.2新鲜培养物上刮1环新鲜细菌，加入培养液中，并依次做10倍梯度稀释至所需要的浓度（约1×108cfu/mL~5×108cfu/mL）。取菌液10ul滴加到载体（10mm×10mm，玻璃片、琼脂片）上，将染菌载片置于37℃温箱内干燥30min后再放置在平板中（每块菌片的回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为5×105cfu/片~5×106cfu/片），备用。
3.1.3在以下三种条件下进行试验，试验重复三次，每次三个平行，取平均值做检测结果：①在室温条件下（30℃培养箱），不接臭氧发生器(A)；②冰箱冷藏室在4℃条件下，不接臭氧发生器（B）；③冰箱冷藏室在4℃条件下，接臭氧发生器，臭氧浓度设定为0.05ppm（C）。
3.1.4将染菌载片放置于3.1.3三种条件下，检测经过4h，12h，24h后，载片上菌落数的变化。
3.2防霉检测方法的研究
3.2.1 菌种活化
将保藏菌接种在PDA斜面培养基试管中，培养7d~14d，使生成大量孢子。未制备孢子悬液时，不得拔去棉塞,每打开1支只供制备1次悬液,每次制备孢子悬液必须使用新培养的霉菌孢子。
3.2.2 将孢子悬液喷洒在改良察氏培养基表面，将其放置在3.1.3三种条件下，观察不加湿、试验空间喷雾加湿的情况下，培养基情况及霉菌生长情况。
3.3结果计算及评定
3.3.1杀菌率计算
杀菌率的计算依据《消毒技术规范》卫生部2002年版-2.1.5灭菌与消毒器械消毒功效鉴定试验。
自然消亡率=[(A-B)/A]×100%；杀菌率=[ (B-C)/B]×100%；
3.3.2防霉结果评定[4]
GB 21551.4-2010家用和类似用途电器的抗菌、除菌、净化功能 电冰箱的特殊要求标准规定，对照样品长霉面积应不小于10%，否则不能作为该试验的对照样品。
4.结果与分析
4.1冰箱抗菌检测方法的研究
 
（a）大肠杆菌 （b）金黄色葡萄球菌
 
（c）白色念珠菌 （d）绿脓杆菌
（e）白色葡萄球菌
 
（f）自然消亡率 （g）杀菌率
图1 不同载片对冰箱杀菌检测方法的影响(A:常温对照，B:对照冰箱，C:杀菌冰箱，自然消亡率=[(A-B)/A]×100%，杀菌率=[ (B-C)/B]×100%)
由图1(a)- (g)可才看出，在冰箱杀菌检测中，以常规的玻片为载体，作用4h时，对照冰箱中的大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌自然消亡率均达到70%以上，12h时，自然消亡率达到99%左右，24h时，自然消亡率达到99.9%；而金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的自然消亡率较小。以琼脂片为载体时，对照冰箱中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌、白色葡萄球菌的自然消亡率均比较小，作用24h后，消亡率均在50%以下。这是因为，冰箱内部是一个低温低湿的环境，以玻片为载体时，大部分微生物由于缺水，自然消亡率高，而部分微生物，如金黄色葡萄球菌对低温低湿的耐受性较强，在干燥环境中，依然可以存活数周，自然消亡率就比较低；以琼脂片为载体时，虽然冰箱内部环境湿度较低，但是琼脂片本身具有一定的水分，为微生物存活提供了需要的水分，自然消亡率就比较低。
在冰箱杀菌检测中，若对照冰箱的自然消亡率较高，对最后杀菌率D的计算有很大的影响。如以玻片为载体时，大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌12h的杀菌率小于4h 的杀菌率，而24h的杀菌率由于对照冰箱的消亡率太高而无法计算。因此，冰箱杀菌检测中，选择合适的载体尤为重要。试验结果说明，琼脂片是冰箱杀菌检测中一种较合适的染菌载体。
4.2冰箱防霉检测方法的研究
表1冰箱防霉检测中不同条件下培养基及霉菌生长情况
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试验
条件
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防霉
检测
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培养基情况
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霉菌生长情况
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不加湿
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A（培养箱）
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试验期间培养基未失水变薄
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试验期间霉菌正常生长，
覆盖至整个培养基表面
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B（对照冰箱）
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试验第二天培养基开始失水变薄
直至干枯
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试验期间霉菌未生长
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C（杀菌冰箱）
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试验第二天培养基开始失水变薄
直至干枯
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试验期间霉菌未生长
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试验空间喷雾加湿
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A（培养箱）
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试验期间培养基未失水变薄
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试验期间霉菌正常生长，
覆盖至整个培养基表面
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B（对照冰箱）
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试验期间培养基轻微失水
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试验期间霉菌正常生长，
覆盖至整个培养基表面
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C（杀菌冰箱）
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试验期间培养基轻微失水
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试验期间霉菌未生长
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冰箱湿度一般是40%-70%[5]，而在运行时，如没有加湿装置，一般只能达到40%左右。由表1可以看出，冰箱防霉中，若不加湿，培养基从试验第二天开始便会失水变薄，对照冰箱和杀菌冰箱中的霉菌均不生长。而依据相关标准，对照样品长霉面积应不小于10%，否则不能作为该试验的对照样品。如果对冰箱试验空间进行喷雾加湿，培养基能较好保持水分，对照冰箱中的霉菌亦能正常生长。但是试验中亦发现，由于冰箱的制冷功能，制冷后，冰箱内的部分水分变成了冰，冰箱不断制冷，虽然进行喷雾加湿，但是湿度保持亦比较难，因此，试验时，除了需要对试验空间进行喷雾加湿，还应该定期对培养基表面加湿。
5.结论
试验表明，由于冰箱的制冷功效，冰箱内部为一个低温低湿的环境，在冰箱的杀菌检测中，若以玻片为载体，对照冰箱中大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的自然消亡率高，作用24h达到99.9%，杀菌率结果差异较大或无法计算，而以琼脂片为载体，由于琼脂片本身具有一定的水分，自然消亡率较低，对杀菌率的计算无影响，因此，琼脂片是冰箱杀菌检测中一种较合适的染菌载体。在防霉检测中，除了需要对试验空间进行喷雾加湿，还应该定期对培养基表面加湿，才能保证培养基和霉菌所需的水分，对照冰箱中霉菌正常生长。
在冰箱的实际使用过程中，一般用来保藏果蔬等食品，因此，建议在检测冰箱杀菌性能的时候，除了用特定的染菌载体，也可以考虑用果蔬等实物表面做载体进行检测，这样更具有代表性。
参考文献
[1]李毕忠，李泽国.家用电器的抗菌除菌净化功能标准对抗菌剂企业发展的影响[J].新材料产业2010,1:43-45
[2]卫生部卫生法制与监督司. 消毒技术规范[ S ]. 北京: 中华人民共和国卫生部, 2002: 20 - 23.
[3]丁年平,黄春喜,周卓为等. 臭氧发生器应用于冰箱的杀菌效果研究[J].家电科技2012,7
[4]GB 21551.4-2010家用和类似用途电器的抗菌、除菌、净化功能 电冰箱的特殊要求
[5]焦岩,张岩,李保国等.湿湿度变化对冰箱中果蔬贮藏质量影响的研究[J].低温与特气，2001，19（6）:18-21
关键词：冰箱；抗菌家电；臭氧；杀菌；抗菌防霉检测
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